Геномика и биология кандидатных бактериофагов для терапии энтеробактериальных инфекций в сельскохозяйственной ветеринарии

Abstract

В монографии представлены результаты научно-исследовательской работы, выполненной ФГБОУ ВО Ульяновский ГАУ под руководством Васильев Д.А. по проекту 16-44-732038 «Геномика и биология кандидатных бактериофагов для терапии энтеробактериальных инфекций в сельскохозяйственной ветеринарии» р_офи_м- Конкурс 2016 года проектов, ориентированных фундаментальных научных исследований по междисциплинарным темам, проводимый совместно ФГБУ «Российский фонд фундаментальных исследований» и Правительством Ульяновской области. В ходе реализации проекта бактериологическими методами и тестами выделено 28 новых штаммов энтеробактерий из объектов внешней среды и патологического материла. Анализ изучаемых бактериальных культур MALDI-TOFF-профилированием подтвердил их соответствие определяемым видам. С использованием усовершенствованных методик, получены 24 новых изолята бактериофагов малоизученных в ветеринарии бактерий родов вышеперечисленных родов семейства Enterobacteriaceae. Создана коллекция вирулентных бактериофагов изучаемой группы бактерий. У выделенных штаммов бактериофагов бактерий родов Proteus, Enterobacter, Citrobacter и вида Yersinia enterocolitica, изучены основные биологические свойства, включающие морфологию негативных колоний, литическую активность, ее спектр, степень специфичности в отношении широкого спектра гетерологичных видов, родов и семейств бактерий, устойчивость к воздействию физических и химических факторов по которым проводится отбор фагов в ветеринарии для терапевтических целей. Из 24 новых изолятов бактериофагов, нами отобраны 3 бактериофага (Pr – 4 УГСХА, Ye3-f2, Е7), обладающих уникальными свойствами необходимыми для конструирования бактериофаговых лечебных биопрепаратов. В результате проведенного секвенирования бактериофагов получены биоинформационные данные нуклеотидных последовательностей и размеры фаговых геномов: Proteus phage Pr 4 - УГСХА (44 580 bp), Enterobacter phage Е7 (36 030 bp) и Yersinia phage Ye3-f2 (39 210 bp). При анализе протеомов изучаемых бактериофагов с помощью разделения выделенных и сконцентрированнных белков фагов в ПААГ методом вертикального электрофореза для Proteus phage Pr 4 – УГСХА было выявлено 3 белка (67 кДа, 77 кДа и 94 кДа), для Enterobacter phage Е7 - 4 белка (73 кДа, 81 кДа, 98 кДа, 124 кДа), для Yersinia phage Ye3-f2 – 3 белка (72 кДа, 115 кДа, 128 кДа). Определено количество протеомов исследуемых бактериофагов, их локализация в геноме, филогенетическое положение среди аннотированных белков, возможная конформационная структура каждого из них.Разработаны системы праймеров для ПЦР типирования бактериофагов Proteus spp., Yersinia enterocolitica, Enterobacter spp. групп. Данные системы позволяют определять наличие бактериофагов, относящихся к определенным группам в материале, полученном из объектов окружающей среды и патологического материала. Изучение взаимодействия фаг-хозяин и выявление факторов, оказывающих влияние на данный процесс, проводили на девяти бактериофагах-кандидатах Proteus spp., Yersinia enterocolitica, Enterobacter spp., устанавливали латентный период внутриклеточного развития изучаемых фагов, их урожайность, время адсорбции и константу скорости адсорбции. С помощью разработанной системы ПЦР-детекции основных факторов патогенности установлено, что в геномах выделенных и селектированных бактериофагов локусов патогенности выявлено не было. По итогам проведенных работ и выполненных исследований разработана классификационная база изучаемых бактериофагов на основе критериев биологических характеристик, особенностей взаимодействия фаг-хозяин, особенностей генетической организации и характеристик протеома. Разработаны методические рекомендации по особенностям культивирования, хранения, очистки и концентрации бактериофагов, активных в отношении энтеробактерий, имеющих важное значение для сельскохозяйственной ветеринарии.